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天津本生解答:DNA提取方法的總結

發布時間:2022-11-17    點擊次數:683

 

  天津本生解答:DNA提取方法的總結

 

  細菌DNA的提?。?/p>

  (一)

  試劑:

  1. 抽提緩沖液

  2% CTAB (W/V)

  2% PVP K25 (w/v) (去色素)

  100mM Tris-HCl (pH8.0)

  25mM EDTA (pH8.0)

  2.0M NaCl

  2.10M LiCl

  3. 2M LiCl

  4.DEPC-water(抑制RNA酶活性)

  5. 3M NaAc (pH5.2)

  6. 96% 乙醇

  7. 70% 乙醇

  細菌DNA的步驟:

  1.抽提緩沖液65℃預熱;

  2. 加菌體到已經預熱的緩沖液(700ul)中混勻,65℃,10min;

  3. 加酚/LV仿/ywc(25:24:1),振蕩,離心12,000rpm,10min;

  4.取上清,加LV/ywc(24:1)振蕩,離心12,000rpm,10min;

  5. 取上清,重復4步驟;

  6. 加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇(或加入等體積的ybc),-20C沉淀;

  11. 離心12,000rpm,10min;

  12. 棄上清,70%乙醇洗,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml 水中。

  (二)(我們常用的方法,但是有時有些細菌特別不好提,就用上面的方法)

  1. 將菌株接種于液體LB培養基,37℃震蕩培養過夜。

  2. 取1.5ml培養物12000rpm離心2min。

  3. 沉淀物加入567 ul的TE緩沖液,反復吹打使之重新懸浮,加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K,混勻,于37℃溫育1h.

  4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混勻,再加入80ul CTAB/NaCl溶液,混勻后再65℃溫育10min。

  5. 加入等體積的酚/LV/ywc混勻,離心4-5min, 將上清轉入一只新管中,加入0.6-0.8倍體積的ybc,輕輕混合直到DNA沉淀下來,沉淀可稍加離心。

  6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇.

  真菌DNA的提?。?/p>

  (一)

  1.取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

  2.加入4mL提取液,快速振蕩混勻

  3.加入等體積的4mL的LV:ywc(24:1),渦旋3~5min(此處是粗提沒有加酚,可以節約成本的喲!)

  4.1000rpm,4℃,5min

  5.上清用體積的LV:ywc(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4℃離心5 min)

  6.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷ybc或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min

  7.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干,重懸于500 ?ulTE中

  8.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃處理1 hr

  9.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃離心5 min)

  10.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

  11.沉淀用75%乙醇漂洗,風干, 溶于200 ulTE中,-20 ℃保存備用

  DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS,

  3M NaAc

  細菌DNA的細菌(二)

  1.真菌菌絲0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉

  2.加入3 mL 65℃預熱的DNA提取緩沖液,快速振蕩混勻65℃水浴30 min, 期間混勻2-3次

  3.加入1 mL 5M KAc,冰浴20 min

  4.等體積的LV仿:ywc(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃離心5 min)

  5.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷ybc, 混勻, 靜置約30 min

  6.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干,重懸于500 ?L TE中

  7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃處理1 hr

  8.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃離心5 min)

  9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

  10.沉淀用75%乙醇漂洗,風干, 溶于200 ul TE中,-20 ℃保存備用。

 

  注:僅供參考!

 

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